Güncel
Bekleyiniz...

 


Mevcut birçok ekstraksiyon yöntemi vardır ve bunlar DNA’yı bereketli bir şekilde ekstrakte etme yetenekleri açısından çeşitlilik gösterir. Dikkate alınacak faktörlerden bazıları, çözümleme edilecek numunenin türü, işlenmesi için gereken zaman, operatör müdahalesi, kontaminasyon riski ve uygulama zorluğu ya da kolaylığıdır. Bu, başarılı adli DNA profillemesinin temelidir. Seçim yönteminin görevi sadece DNA’nın her bir örnekten verimli bir şekilde …

Mevcut birçok ekstraksiyon yöntemi vardır ve bunlar DNA’yı bereketli bir şekilde ekstrakte etme yetenekleri açısından çeşitlilik gösterir. Dikkate alınacak faktörlerden bazıları, inceleme edilecek numunenin türü, işlenmesi için gereken zaman, operatör müdahalesi, kontaminasyon riski ve uygulama zorluğu veya kolaylığıdır. Bu, başarılı adli DNA profillemesinin temelidir. Seçim yönteminin görevi yalnızca DNA’nın her bir örnekten bereketli bir şekilde ekstrakte edilmesini sağlamakla kalmaz, aynı zamanda amplifikasyon gibi diğer süreçlere müdahale edebilecek muhtemel inhibitörleri de ortadan kaldırmalıdır.

DNA Ekstraksiyon YöntemleriDNA Ekstraksiyonu İçin Teknikler

DNA ekstraksiyonunda kullanılan en yaygın tekniklerden biri, DNA’yı bozulmadan koruyan geçiş metal iyonlarını bağlantı kurmak için iyon değişimini kullanan bir kenetleme reçinesi olan Chelex’tir. Chelex yönteminin avantajı seri olması, çoklu tüp transferleri gerektirmemesi ve toksik organik çözücüler kullanmamasıdır. Başlıca dezavantajı, amplifikasyon sürecine müdahale eden inhibitörleri çıkaramamasıdır. İnhibitörlü numuneleri işlerken, proteinleri denatüre etmek ve DNA’yı hücreden serbest bırakmak için deterjanlar ve proteazlar taşıyan bir tuzlu solüsyonu kullanılır. Bu tuz suda gerçekleştirilen hücrelerin parçalanmasını gerektiren organik ekstraksiyon yönteminin kullanılması nasihat edilir.
Bu kokteyl, DNA’yı sulu fazda bırakan bir fenol-kloroform-izoamil alkol karışımı kullanılarak ayrılabilir. Ekstrakte edilen DNA sulu fazdan etanol çökeltme aracılığıyla ya da numunelerde DNA’nın ek saflaştırılmasına ve konsantrasyonuna müsade veren bir santrifüjlü filtre ünitesi ile konsantre edilebilir. Organik ekstraksiyon yönteminin avantajı, zor örneklerden (bozulmuş ve / ya da düşük miktarda DNA) kalıtımsal materyal elde edebilmesidir. Keza PCR için inhibitörlerin varlığını başarılı bir şekilde ortadan kaldırabilmesidir. Bu yöntem en güvenilir ve verimli yöntemlerden biri olmaya devam ederken, bununla birlikte çok süre alıcıdır. Güvenli Olmayan kimyasallar kullanır ve daha artı uygulamalı uğraş ve dahil olan çoklu tüp transferleri sebebiyle kontaminasyon ve numunelerin hatalı kullanımı için büyüyen riskler ortaya çıkarır.

DNA Karışımlarında Diferansiyel Liziz

Cinsel suçlarda toplanan kanıtların kalıtımsal analizi genelde iki veya daha artı katılımcının genetik profillerini içerir. Bu nesil karışımlarda, bireylerin genetik katkısı genellikle dengesizdir. Bir Takım durumlarda, biyolojik karışım asgari düzeyde bir katkıda bulunur, genellikle cinsel saldırı vakalarında faildir. Bu donörün kalıtımsal oranı, duyarlık sınırları veya daha fazla miktara sahip bileşen göre tepkime doygunluğu nedeniyle muhtemelen tespit edilmez. Birçok durumda, oranlar 1: 20’yi aştığında, DNA karışımındaki minör katkı maddesi saptama edilemez.
Cinsel hücum vakalarında kanıtların elde edilmesi, DNA adli tıp analistleri için büyük bir zorluktur. Çünkü DNA’nın epitel (kurban) ve sperm (fail) hücrelerinden ayrılmasını gerektirir. Diferansiyel ekstraksiyon ilk olarak 1986 yılında Gill ve ekibi kadar organik fenol-kloroform ekstraksiyonunun bir modifikasyonu olarak tanımlanmıştır. Ve buna diferansiyel lizis adı verilir çünkü sperm dışı hücreler deterjan ve proteazlarla seçici olarak parçalanır. Sperm ise sperm başındaki proteaz tedavisine boyun eğmez ağır disülfit çapraz yan proteinler sebebiyle hücreler parçalanmaz. DNA adli tıp laboratuvarlarında, diferansiyel lizis yöntemi, spermatozoayı epitel hücrelerinden parçalamak için uzun süredir standart olmuştur. Bu teknik teorik olarak daha önce belirtildiği gibi teorik olarak iki fraksiyon sağlayabilse de, bölünme defalarca tamamlanmayarak girift genotiplerle sonuçlanır.

Öteki DNA Ekstraksiyon Yöntemleri

Sperm ve epitel hücrelerini cinsel atak örneklerinden ayırmanın başka yöntemleri de vardır. Differex ™ sistem yöntemi, epitel hücrelerinin proteinaz K-seçici sindirimini, ardından diferansiyel santrifüjlemeyi ve safha ayrılmasını içerir. Bu yöntemin DNA laboratuvarlarında kullanılması, girift lekelerden sperm DNA’sının çıkarılması için iki kademeli yönteme eşit verimlilik sunduğunu göstermektedir.

İnsan Açıklama İçin Moleküler Yöntemler

Adli bir ortamda DNA testinin birincil kullanımı 1986’da olmuştur. İngiltere’de Leicestershire’da iki kız çocuğu cinsel saldırıya uğramıştır, ardından 1983 ve 1986’da barbarca öldürülmüştür. Bu dava bir masumun suçlandığını ve 1 sene sonra suçlu suçlunun bulunup işlendiğini göstermiştir. Son 30 yılda, DNA moleküler analizi adli araştırmalarda manâlı bir araç haline gelmiştir. Günümüzde, DNA profili, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) analizlerine dayanmaktadır. Bu yöntem, otozomal STR’leri, Y ve X kromozomlarını içerir. PCR, bir bölgenin birçok kopyasını olmak için genom üzerindeki kayıtlı bir bölgeyi her zaman yükselme işlemidir.
PCR’den önce DNA’nın ölçülmesi gerekir ve bu dürüst amplifikasyonunu sağlamak için bu çok önemlidir. Ilk amacı, izolasyondan kaynaklanan DNA şablonunun miktarını belirlemektir. Bambaşka doğrulukta birçok usul vardır, oysa örneklerde bulunan DNA konsantrasyonunu anlayışlı olmak, adli tıp bilimcisinin, kalan bir genetik profil elde etmeyi muhtemel kılmak amplifikasyonu için gereken ideal DNA miktarını oluşturmasına müsade verir. Cinsel suçlarda toplanan kanıtların genetik analizi genellikle iki ya da daha fazla katılımcının genetik profillerini içerir. Bu tür karışımlarda, bireylerin kalıtımsal katkısı genelde dengesizdir. Bu, muhtemelen PCR’yi etkilediği tanıdık tercihli amplifikasyon gibi bir dizi stokastik tesir yoluyla yorumlama sürecini daha çook bozar.

Kısa Tandem Tekrar (STR) Analizi

Mikro uydular veya STR ’ler, art arda tekrarlanan bir nükleotid çekirdeği içerir ve adli bilimlerde kullanımları insan tanımlamasında yeni bir yol açmıştır. STR’lerin, fazla sıvı belirteçleri nedeniyle yüksek derecede ayrımcılığa sahip oldukları iyi bilinmektedir. Bu, failin suç mahalline ya da mağdura dahil edilmesi amaçlandığında yararlıdır. Artefaktlar, adli vakalarda sık karşılaşılan bir sorundur. Biyolojik olanlar ve enstrümantal olanlar, eksiksiz ve dürüst bir STR profili meydana getirmek için genel olarak sıralanmalıdır. Parçalanmış DNA’yı bildiren biyolojik kanıtlar çoğunlukla cinsel saldırı vakalarında bulunur. Ve PCR ürünleri daha ufak olduğunda daha etkin bir şekilde geri kazanılabilir. PCR primerlerini STR bölgesine yaklaştırarak, aynı bilgiler korunurken ürün boyutları azaltılabilir. Uygulamada, tehlikeye atılmış DNA örneklerinden bilgilerin kurtarılmasındaki galibiyet oranları, geleneksel STR kitlerine kıyasla küçük STR sistemleriyle artar.
DNA Ekstraksiyon YöntemleriCinsiyet kromozomal STR, bir kişinin biyoloji ile ilgili soyunu gösterir ve akrabalar aralarında düşük bir dışlama gücü elde eder. Y-STR belirteçleri, öbür ekstraksiyonun olası olmadığı durumlarda, azospermik bir erkekte veya yaşlı cinsel lekelerde aleyhinde cinsten girift profiller laf konusu olduğunda rol oynayabilir . X-STR markörleri çok çeşitli adli uygulamalara sahiptir, teyze, yeğen ve kuzenler gibi akrabalar arasındaki ilişkiyi kurmak için kullanılabilir. Keza, teorik ve birincil ampirik delil, 13 RM Y-STR setinin (şipşak değişen Y-STR’ler) erkek izafi farklılaşmadan daha yüksek bir cömertlik sırasına ulaşabildiğini kullanmak için sağlanmıştır. Bu neredeyse işlenmiş erkek bireyselleşmesinin etkileri, adli tıp uygulamalarında büyük avantaj sağlar. Mesela, adventif haplotip eşleşmeleri sebebiyle masum bireylerin cinsel araştırmalara dahil edilmesini azaltmak için kullanılabilir.

Tek Nükleotid Polimorfizmleri (SNP’ler) Analizi

SNP’ler, belirtilmiş bir noktada bireyler aralarında tek bazlı bir dizi varyasyonudur ve insan genomundaki milyonlarca bölgede yer alır. Bu da bireyleri birbirinden ayırt edebilecekleri anlamına gelir. SNP’ler, stokastik fenomen göstermeyen bozulmuş DNA örneklerinden bilgileri kurtarabilir. Misal işleme ve data analizi daha otomatik ülkü getirilebilir çünkü boyuta dayalı bir ayrıma lüzum yoktur. Hem ırksa köken ve belirtilmiş bedensel özellikleri tahmin etme yeteneğine sahiptir. Adli DNA tipleme uygulamalarında SNP’leri kullanmanın en büyük zorluklarından biri, küçük miktarlarda DNA’dan sağlam PCR multiplekslerinde tatmin edici sayıda SNP’yi aynı anda amplifiye edememektir.
Tek bir SNP, çok alelik bir STR işaretleyiciden daha az data verdiğinden,akılcı bir ayrım gücü olmak için daha artı sayıda SNP’yi çözümleme edilmeis gerekir. Bir Zamanlar, yüksek yoğunluklu SNP dizileri, yüz binlerce hatta milyonlarca SNP’nin paralel olarak tahlil edilmesine müsade vermiştir. SNP dizisinin temel ilkeleri, DNA hibridizasyonunun yakınsaması, floresan mikroskobu ve katı yüzey DNA yakalamadır. SNP dizilerinin üç gerekli bileşeni, hareketsizleştirilmiş alele özgü oligonükleotid (ASO) probları taşıyan bir dizidir. Floresan boyalarla etiketlenmiş, hedefin parçalanmış nükleik asit dizileri, hibridizasyon sinyalini kaydeden ve yorumlayan bir saptama sistemidir. aynı zamanda, bu diziler tipik olarak yüzlerce nanogram DNA gerektirir. Bunlar çoğunlukla ufak biyolojik lekelerden kaynaklanan adli olgu örneklerinden elde edilememektedir. Hem bu nedenle ata çalışmalarında daha sık kullanılmaktadır.
Bir bialelik ya da di-alelik polimorfizmin diğer bir formu, nükleotidlerin veya bir DNA segmenti olabilen INDEL’in sokulması-silinmesidir. Birçok INDEL, birkaç nükleotid uzunluk farklılığından oluşan alel sergiler. PCR amplikonları 160 bp’den daha az olacak şekilde tasarlanmıştır ve bununla takriben 300 pg DNA şablonuna kadar bütün bir profil elde edilebilmiştir. bununla beraber, bütün INDEL’ler tüm popülasyonlarda oldukça bilgilendirici değildir ve insan genomundaki INDEL’lerin bütün sayısı bilinmemektedir.
Keza SNP’ler keza de INDEL’ler artık bütün rutin adli tıp laboratuvarlarında bulunan cihazlarda parça uzunluğu analizine dayalı multipleksler kullanılarak tiplendirilebilir. Bu Nedenle markör aralığını kullanılan STR’lerin ötesine genişletmeyi muhtemel kılar. Son yıllarda, çok sayıda SNP’ye dayalı haplotip sistemleri, analiz için dinç bir alternatif karşılayan STR’lerinkine yakın ayırt edici güçleri nedeniyle adli bölge için optimal belirteçler olarak denenmektedir. Mikrohaplotipler (MH’ler), 200 nükleotidden daha az bir aralıkta 2 veya daha artı SNP’ye sahiptir. Son derece düşük rekombinasyon oranları, parçalanmış DNA ve karışım örnek analizi olan durumlarda yardımsever STR’lere aynı ayırt etme gücü vardır.

Mitokondriyal DNA Analizi

Mitokondriyal DNA (mtDNA) analizi genel olarak Sanger dizileme kimyası kullanılarak yapılır. Bu DNA sıralaması, keza ileri ayrıca de zıt yönde gerçekleştirilir. Bu Nedenle tamamlayıcı iplikler, kalite yoklama nedeniyle birbirleriyle karşılaştırılabilir. Bugüne kadarama birçok adli DNA çalışmasının odak noktası, kontrol bölgesinde genellikle HVI (HV1) ve HVII (HV2) olarak adlandırılan iki hiper akıcı bölgeyi içermektedir. zaman zaman denetleme bölgesinin HV3 olarak tanıdık üçüncü bir kısmı, deneme edilen bir örnekle ilgili daha artı veri karşılamak için incelenir. İnsan mitokondriyal DNA’sının şüphesiz annelerden servet kaldığı düşünülür ve genel olarak ebeveyn bağlarında kullanılır.
Ortadaki sperm hücresi parçası mtDNA içerir ve bu DNA otozomal DNA’dan daha dirençlidir. Çünkü ufak dairesel genomlarda, mitokondrinin çift zarı ve dairesel yapı biçimsizleşme süreçlerine aleyhinde koruyucu ajanlar olarak işlev görür. MtDNA için adli tıp uygulamaları, bozulmuş ya da düşük miktarda DNA içeren örneklerin analizini içerir. Ve bu, Çar II. Nicholas ve kardeşi Georgij Romanov’un kimliğinin belirlenmesi için kullanılmıştır . Fiziksel ayırmanın yanı sıra, kadının mtDNA’sının birlikte amplifiye edilmemesini temin etmek için erkek için sekansa özgü primerler (SSP) kullanılmıştır. Primer tasarımı, bukkal sürüntülerin mtDNA analizinden sonra belirlenen katılımcılar arasındaki mtDNA haplotip farklılıklarına dayanmaktadır. Bu prosedür, bir vajinal çubukta bulunan tek bir sperm hücresinden erkek mitotipinin karakterizasyonuna olanak tanır ve tanımlanmasında kullanılmıştır. Yakın zamanda yapılan yaklaşımda mtDNA’nın mikromanipülasyon tekniği ile vajinal kanaldaki sperm hücrelerinin tanımlanmasında kullanılabileceği gösterilmiştir.

Kaynakça:
europepmc.org/articles/pmc4637504
scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1516-31802002000300004

Yazar: Özlem Güvenç Ağaoğlu

0 Yorumlar: